FISH １．    標本作製，固定 未固定組織標本をスライドグラスに接触させ細胞を接着させる． 直ちにドライヤーなどで十分に冷風乾燥． カルノア固定                   ４℃，１０〜１５分． 冷風乾燥． ２．標本前処理 観察領域を，ダイヤモンドペンでマークする． 2XSSC                            37℃　10分 0.5mg/ml Pepsin                37℃　13分（便宜，材料で調整） PBS                                  　　　　5分（室温） 1％formaldehyde                        　5分 PBS                                         　5分 70 %, 85 %, 100 % Alc.                 　各1分 Air dry または，加熱（60℃〜70℃，２時間）によるヒートエージング． ３．標本変性 予め73℃に加温した変性溶液中に標本を３分間（便宜，材料で微調整）浸す  直ちに冷アルコールにて脱水．  70％，85％，100％エタノール各１分間．   ドライヤーで十分に冷風乾燥． ４．Probe調整，変性 Hybridization Buffer 7μl, 標的プローブ 1μl, 蒸留水2μl, を0.5ml エッペンチューブ内で混合し，２〜３秒間遠心する． 75℃ウォーターバスで５分間加温してプローブを変性させる． 氷浴中にて急冷保存． ５．ハイブリダイゼーション 37℃のホットプレートに標本を載せる． プローブミックス10μl添加し，カバーガラスをかけペーパーボンドで シールする． 湿潤箱に標本を入れ，37℃で一昼夜インキュベートする． ６．洗浄               ペーパーボンドを剥がす．               45℃に加温した洗浄液1に10分間（カバーガラスが自然落下)               45℃に加温した洗浄液2，3に各10分間洗浄．               45℃に加温した2×SSCで10分間洗浄．               2×SSCで5分間洗浄．               PN buffer で５分間洗浄後，蒸留水で５分間洗浄し軽く乾燥させる．               DAPI�U10 μl 添加し，カバーガラスをかけマニキュアでシールをする． （参考）Two-color FISHのプローブ調整               Hybridization Buffer                               7μl               セントロメアプローブ（Spectrum Green）       1μl               領域特異的プローブ(Spectrum Orange)     　 1μl               蒸留水                                            　　 １μl       total 10μl      　 混和，遠心後、変性する．他は同様に行う． 試薬 1％formaldehyde 10% 中性緩衝ホルマリン           12.5ml PBS                                   　  37ml 2M MgCl2                                   　　 0.5ml 変性溶液(pH 7.0)        100% formamide                    70ml        20×SSC                            10ml        H2O                                  20ml ハイブリダイゼーション溶液 　　ホルムアミド　　　　　　　　　　　　　5.5ml 　　硫酸デキストラン　　　　　　　　　　1.0g 　　20×SSC 　　　　　　　　　　　　　　0.5ml *粘土が高いため撹拌に注意  洗浄液(pH 7.0)          100% formamide                  　 50ml          20×SSC                             10ml          H2O                                   40ml               2×SSC / 0.1% NP-40 (pH 7.0 ) 　　　　20XSSC                                100ml         NP-40                                  1ml         H2O                  total        1,000ml               PN buffer (pH 8.0)                             A液：0.1M Na2HPO4 / 0.1% NP-40                             B液：0.1M NaH2PO4 / 0.1% NP-40 　　　　　　　　　　　　　　 A液にB液を加えながら，pH 8.0に調整

Tharmal Cyclerを使用したFISH １．標本固定 カルノア固定                       4℃　10〜15分 風乾 ２．標本前処理 2XSSC                                   37℃　10分 0.5mg/ml Pepsin                       37℃　13分 PBS                                               　5分 1％formaldehyde                                 5分 PBS                                                 5分 70 %, 85 %, 100 % Alc.                        各1分 風乾 ３．DNA変性とハイブリダイゼーション         Thermal cyclerに標本をセット 調整したプローブを添加しカバーガラスを載せる ペーパーボンドでシールをする               プログラムスタート　 73℃　3分（変性）→→→　37℃ 一昼夜 （ハイブリダイゼーション） ４．迅速洗浄法           ペーパーボンドを取り除く               2XSSC                                       5分（カバーガラスを剥がす）               0.4XSSC/0.3%NP-40              73℃ 2分               2XSSC/0.1%NP-40                5秒, - 1分               2XSSC                                     再洗浄 ５．対比染色 DAPI�U　１０μl （標本が完全に乾く前に，DAPI�Uを添加しカバーガラスを載せる） （参考）Two-color FISHのプローブ調整               Hybridization Buffer                                        7μl               セントロメアプローブ（Spectrum Green）               1μl               領域特異的プローブ(Spectrum Orange)               1μl               蒸留水                                                        １μl     　　total  10μl 　　試薬 0.5mg/ml pepsin (pH2.0) 0.01N-HCl                                           50ml 10% pepsin                                        0.25ml 1% formaldehyde          10% 中性緩衝ホルマリン                  12.5ml          PBS                                              37ml          2M MgCl2                                                 0.5ml 0. 4XSSC/0.3%NP-40 (pH 7.0) 20XSSC                                                20ml NP-40                                                   3ml H2O                                     total      1,000ml 2XSSC/0.1%NP-40 (pH7.0)    20XSSC                                       100ml    NP-40                                            1ml    H2O                                      total      1,000ml

FISH on formalin-fixed paraffin-embedded tissue section 　　Day 1 　　1. 6% neutral-buffred formalin fixation 　　2. Paraffin-wax embedment 　　3. Prepare 4-6 μm tissue section slide 　　4. Xylene 10 min X3 　　5. Ethanol 10 min X2 　　6. Microwave-heating for 15 min (0.01M sodium citrate buffer, pH 　　　　6.0)→H2O (approximate 2 min)→PBS (approximate 2 min) 　　7. 0.05%-0.5% pepsin/0.1N HCl  at 37℃ for 12 min. 　　8. H2O (approximate 2 min) X2 　　9. 70% Ethanol (2 min)→85% Ethanol (2 min)→100% Ethanol (2 min)→air dry 　　10. Preheating of section slide (place the slide on the lid of water 　　　　bath at 73℃ before preparation and denaturation of probe solution) 　　11. Prepare probe solution (for example: 7μl hybridization buffer + 1μl 　　　　probe + 2 μl DDW for CEP probe, Vysis) 　　12. Denature probe solution at 73℃ for 5 min then move to 45℃ 　　13. Denature the section in a denaturation solution at 73℃ for 5 min. 　　14. 70% Ethanol (2 min at -4 to -20℃)→85% Ethanol (2 min at -4 to 　　　　-20℃)→100% Ethanol (2 min at -4 to -20℃)→air dry 　　15. Hybridization at 37℃→ cover and seal the section with coverslip and 　　　　rubber cement 　　16. Mark on the section slide 　　17. Incubation at 37℃ for 3 days 　　Denaturation solution  　　 7ml 20X SSC 　　14ml H2O 　　49ml formamide   　　Day 4 　　1. Remove rubber cement from slide and immerse in 2X SSC/0.3% NP-40 at 　　　　room for 2-5 minutes. 　　2. 2X SSC/0.3% NP-40 at 73℃ for 2 minutes 　　3. 2X SSC/0.3% NP-40 at room for 1 minute 　　4. 70% Ethanol (1 min)→85% Ethanol (1 min)→100% Ethanol (1 min)→air dry 　　5. Counterstain and apply coverslip→observation under fluorescence 　　　　microscope. 　　2X SSC/0.3% NP-40 　　4ml 20X SSC 　　36ml H2O 　　120μl NP-40 このページのTOPへ

Comparative Genomic Hybridization(CGH) ・染色体標本スライドの前処理 カルノア固定　                                                   4℃　30分 風乾（しっかり乾かす） ２×SSC                                                             　10分（エージング） ペプシン処理　７分　　(0.5mg/ml pepsin pH2.0)（結果をみて適宜調整） PBS                                                                      ５分 １% formaldehyde                                                      ５分 PBS　５分 70%, 80%, 100% エタノール                       　　　　　　　　 各１分 風乾 75℃ウォーターバスのステンレス製蓋の上に放置　2時間 ・試薬 1% formaldehyde                10%中性緩衝ﾎﾙﾏﾘﾝ　　　　　        12.5ml 　　　　　　　　１×PBS                                   37ml 　　　　　　　　２M　MgCl2                              0.5ml 0.5 mg/ml pepsin (pH 2.0)                  0.01N-HCl で希釈　　 10%　ペプシン　0.25ml 　　　　　　　H2O          　 50ml               1N HCl         500μl ・プローブの単鎖化処理（0.5mlの黄色ﾁｭｰﾌﾞが便利） １）  プローブの作成（上から順番に入れる） 　　　Human COT-1 DNA　　　　　　　　　　　　　　　　　 10 μl 　　　３M　酢酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.0 μl 　　　100%　エタノール（上等なの）                        110 μl 　　　正常人リンパ球DNA（Spectrum Red 標識）　　　 10 μl 　　　腫瘍DNA（Spectrum Green 標識）                   20 μl 　　以上をよく混和ﾞする。 ２）　遮光箱に容れ、転倒混和し−80℃に一晩置く（１時間以上置く） ３）　12000回転4℃ 20分遠心 ４）　上清を捨てる。 ５)　　70% エタノールを200 μl入れ12000回転10分 ６）　上清を捨て、紙縒で残った水分を吸い取る。 （ここで、DNAの白い塊を紙縒にくっつけない様に気をつける。遮光しながら乾かす。（1 - 2時間程度） ７）　Master Mixを10μl加えよく混和する。管壁についたMaster Mixを10秒程度遠心して落とす。 ８）　３７℃で約１０分保温（遮光） ９）　チューブ内のプローブを撹拌する。 １０） ４５℃に１０〜１５分静置。 １１） ７５℃に６分処理。（ﾌﾟﾛｰﾌﾞの変性） １２） ３７℃に３０分以上静置。 ・染色体標本の単鎖化処理 １）    スライドグラス（スライドの裏に印をつける）を37℃に10分ぐらい置いて 　　　75℃の上に１時間〜２時間置く。 ２）    Denaturing　Solution（75℃）にスライドグラスを２分１０秒〜２分３０秒（単鎖化） 注）スライドグラスを１枚入れると約１℃下がるので１度に２枚以上処理しない。 ３）　70．80．100 ％エタノール（氷中）にて２分間づつ脱水する。 ４）　風乾する。 ５）　37℃のホットプレート上で温めておく。 ・ハイブリダイゼーション １）    スライドグラスにプローブを10 μl滴下する。 ２）    18×18mmのカバーグラスにて被い、ペーパーボンドで周囲をシールする。 ３）    30分間ホットプレート（37℃）上に静置する。 ４）    37℃の恒温室にて72時間ハイブリダイゼーションする。   ・洗浄 １）    ５０％ﾎﾙﾑｱﾐﾄﾞ/2×SSC 45℃　　６分×３回 ２）     ２×ＳＳＣ　45℃　　         　　　　７分×１回 ３）     ＰＮ　　　　　　　　　        　　　　　 ５分×１回 ４）     ＤＷ　　　　　　　　　        　　　　　 ５分×１回 ５）     水を切って37℃のホットプレート上に５分〜10分（乾燥を確認） ６）  ＤＡＰＩ�U 10μlを滴下し、18×18ｍｍのカバーグラスをかけマニキュアでシールする。 乾燥後プ レパラート箱に入れ常温で保存。 ・試薬の調整 20×SSC 　　　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　　　　　43.8ｇ　　　　175.3g         C6H5O7Na3・2H2O　　　　　　　　 22.1ｇ　　　　88.2g         蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　200ml　　　　800ml         メスアップ用（蒸留水）　　　　　　　　　＋α          ＋α 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　250ml         1000ml 　　PHメーターでPHを7.0に１NのHClであわせその後メスアップ。 ・変性溶液（D.S）100ml ホルムアミド70ml　・20×SSC（ｐH7.0）10ml　・蒸留水20mlを加えて良く混合する。PH7.0 であることを確かめる。 ・エタノール洗浄液 蒸留水と100％エタノールを用いて70％　80％　100％の最終濃度となるように希釈する。 ・ホルムアミド洗浄液50 %formamid/2×SSC ホルムアミド75ml　20×SSC(pH7.0)15ml  蒸留水60mlを良く混合する。室温でｐHメーターを用いてｐH7.0に調整する。3個のガラス製コプリンジャー（1，2，3と表示して）に入れる。 ・PN　2×SSC/0.1％NP−40（100ml） 90mlの蒸留水に20×SSC（ｐH7.0）を10ml加える。0.1mlのNP―40を加える。NaOHでｐH 7.0に調整する。

MicroDissection PROTOCOL FOR MANUAL TISSUE MICRODISSECTION This method is applicable to various kinds of cancer tissues to reduce stromal tissue components from cancer specimens. Investigators should also expect to invest time initially by practicing on 10 to 20 cases to begin to feel comfortable with the technique. As they become skilled in the microdissection technology, they obtain tissue fragments rich in cancer cells in a short time. I. Preparation of frozen tissue sections 1.  Set the machine (cryo-stat) for -20℃ (It takes at least a few hours to get the optimal temperature. Fortunately, the machine is usually maintained at -20C in this laboratory.)   2. Squeeze one drop of OCT compound (Tissue Tek) in bottom of mold, then put the tissue specimen in the center of it, and full the mold by OCT compound. (avoid to trapping air bubbles) *Embed fresh tissues carefully in OCT in plastic mold, taking care not to trap air bubbles surrounding the tissue. Freeze tissue by setting mold on top of liquid nitrogen until 70-80% of the block turns white and then put block on top of dry ice. The frozen blocks may be stored at minus 80°C for long-term　storage. 3.  Put mold in machine for 20-30 minutes. This process can be omitted, when the tissue specimens frozen by another method are used. 4.  Take out the cylinder from machine and placed one drop of compound    on up of fit for mold fixation, Convert the mold and put in top of the     cylinder, leave it for 10 minutes in the machine.   5. Remove mold’s frame (plastic). 6. Adjust the cylinder for tissue sectioning. 7. Cut the tissue block with a razor at 5μm, and put on the slide nicety.  (A tissue section is prepared for microscopic observation. When the density of cancer cells is very low, another tissue specimen should be used.) 8. Then, section the tissue block at 30μm. 9. Make totally 12-16 slides with repeat of procedures No. (7 to 8 ). 10. Leave slides in Ethanol 100% for 5minutes.   11. Stain tissue sections with HE. The lower concentration of hematoxylin and eosin may improve macromolecule recovery.   12. Arrange slides on the map-wood, and put a cover glass only on 5μm-Sections. We should evaluate the cancer cell content in the tissue section before beginning microdissection.  II. Tissue microdissection - Picking up the cancer cells We perform microdissection on a standard inverted microscope (stereomicroscope) using a 27 gauge needle on a syringe as the microdissecting tool. Prepare in advance;    �@1.5ml-eppendorfe tube                          　　�A70%-ethanol                   　　　　　　�B1ml-syringe with 27G needle 1.  At first, spill a little of Ethanol on the slide, look for cancer cell    nest, and take out that by needle of syringe, put it in the eppendorf    tube (tube with 1/2 volume alcohol). While viewing the tissue through the microscope, the cell population of interest should be gently scraped with the needle. (As another way, first stromal tissues are removed from cancer tissue specimens, and cancer cell populations are left on the slide.) The dissected cells will become detached from the slide and form small dark clumps of tissue that can be collected on the needle. Several small tissue fragments can be procured simultaneously. Collection of an initial fragment on the tip of the needle will assist in procuring subsequent tissue. The tip of the needle with the procured tissue fragments should be carefully placed into a small PCR tube containing ethanol. Gentle shaking of the tube will ensure the tissue detaches from the tip of the needle. 2.  Centrifuge the tube for 5minutes at 14,000rpm. 3. Remove the alcohol only, soak the tissue fragments in PBS, and centrifuge the tube for 5 minutes at 14,000rpm.   4. Remove PBS.   5.  Go to the DNA extraction step (Dneasy tissue kit, QIAGEN, or SepaGene, Sankojunyaku Co., Ltd.)   DNA EXTRACTION FROM MICRODISSECTED TISSUE SPECIMENS DNA extraction is performed with a DNA extraction kit according to the manufacturer’s instructions. We use two kits (products of Sanko-junyaku and Quagen) for DNA extraction.