FISH Thermal Cycler を使用したFISH FISH on formalin-fixed paraffin-embedded tissue section Comparative Genomic Hybridization (CGH) MicroDissection Mutiplex-Immunostain chip (M-I chip) １． 標本作製，固定 未固定組織標本をスライドグラスに接触させ細胞を接着させる． 直ちにドライヤーなどで十分に冷風乾燥． カルノア固定　 ４℃，１０～１５分． 冷風乾燥． ２． 標本前処理 観察領域を，ダイヤモンドペンでマークする． 2XSSC 37℃ 10分 0.5mg/ml Pepsin 37℃　13分（便宜，材料で調整） PBS 5分（室温） 1％formaldehyde 5分 PBS 5分 70 %, 85 %, 100 % Alc. 　 各1分 Air dry または，加熱（60℃～70℃，２時間）によるヒートエージング． ３． 標本変性 予め73℃に加温した変性溶液中に標本を３分間（便宜，材料で微調整）浸す 直ちに冷アルコールにて脱水． 70％，85％，100％エタノール各１分間． ドライヤーで十分に冷風乾燥． ４． Probe調整，変性 Hybridization Buffer 7μl, 標的プローブ 1μl, 蒸留水2μl, を0.5ml エッペンチューブ内で混合し，２〜３秒間遠心する． 75℃ウォーターバスで５分間加温してプローブを変性させる． 氷浴中にて急冷保存． ５． ハイブリダイゼーション 37℃のホットプレートに標本を載せる． プローブミックス10μl添加し，カバーガラスをかけペーパーボンドでシールする． 湿潤箱に標本を入れ，37℃で一昼夜インキュベートする． ６． 洗浄 ペーパーボンドを剥がす． 45℃に加温した洗浄液1に10分間（カバーガラスが自然落下) 45℃に加温した洗浄液2，3に各10分間洗浄． 45℃に加温した2×SSCで10分間洗浄． 2×SSCで5分間洗浄． PN buffer で５分間洗浄後，蒸留水で５分間洗浄し軽く乾燥させる． DAPIⅡ10 μl 添加し，カバーガラスをかけマニキュアでシールをする． （参考）Two-color FISHのプローブ調整 Hybridization Buffer 7μl セントロメアプローブ（Spectrum Green） １μl 領域特異的プローブ(Spectrum Orange) １μl 蒸留水 １μl total 10μl 混和，遠心後、変性する．他は同様に行う． 試薬 1％formaldehyde 10% 中性緩衝ホルマリン 12.5ml PBS 37ml 2M MgCl2 0.5ml 変性溶液(pH 7.0) 100% formamide 70ml 20×SSC 10ml H2O 20ml ハイブリダイゼーション溶液 ホルムアミド 5.5ml 硫酸デキストラン 1.0g 20×SSC 0.5ml *粘度が高いため撹拌に注意 洗浄液(pH 7.0) 100% formamide 50ml 20×SSC 10ml H2O 40ml 2×SSC / 0.1% NP-40 (pH 7.0 ) 20XSSC 100ml NP-40 1ml H2O total 1,000ml PN buffer (pH 8.0) 　A液：0.1M Na2HPO4 / 0.1% NP-40 　B液：0.1M NaH2PO4 / 0.1% NP-40 　A液にB液を加えながら，pH 8.0に調整 ▲ページトップへ １． 標本固定 　カルノア固定 4℃　10〜15分 　風乾 ２． 標本前処理 2XSSC 37℃ 10分 0.5mg/ml Pepsin 37℃ 13分 PBS 5分 1％formaldehyde 5分 PBS 5分 70 %, 85 %, 100 % Alc. 各1分 風乾 ３． DNA変性とハイブリダイゼーション Thermal cyclerに標本をセット 　調整したプローブを添加しカバーガラスを載せる 　ペーパーボンドでシールをする プログラムスタート 　73℃　3分（変性）→→→　37℃ 一昼夜 　（ハイブリダイゼーション） ４． 迅速洗浄法 ペーパーボンドを取り除く 2XSSC 5分（カバーガラスを剥がす） 0.4XSSC/0.3%NP-40 73℃ 2分 2XSSC/0.1%NP-40 5秒, - 1分 2XSSC 再洗浄 ５． 対比染色 　DAPIⅡ　１０μl 　（標本が完全に乾く前に，DAPIⅡを添加しカバーガラスを載せる） （参考）Two-color FISHのプローブ調整 Hybridization Buffer 7μl セントロメアプローブ（Spectrum Green） 1μl 領域特異的プローブ(Spectrum Orange) 1μl 蒸留水 １μl total 10μl 試薬 0.5mg/ml pepsin (pH2.0) 　　　0.01N-HCl 50ml 　　　10% pepsin 　 0.25ml 1% formaldehyde 　　　10% 中性緩衝ホルマリン 　 12.5ml 　　　PBS 37ml 　　　2M MgCl2 0.5ml 0. 4XSSC/0.3%NP-40 (pH 7.0) 　　　20XSSC 20ml 　　　NP-40 3ml 　　　H2O total 1,000ml 2XSSC/0.1%NP-40 (pH7.0) 　　　20XSSC 100ml 　　　NP-40 1ml 　　　H2O total 1,000ml ▲ページトップへ Day 1 １． 6% neutral-buffred formalin fixation ２． Paraffin-wax embedment ３． Prepare 4-6 μm tissue section slide ４． Xylene 10 min X3 ５． Ethanol 10 min X2 ６． Microwave-heating for 15 min (0.01M sodium citrate buffer, pH 6.0)→H2O (approximate 2 min)→PBS (approximate 2 min) ７． 0.05%-0.5% pepsin/0.1N HCl at 37℃ for 12 min. ８． H2O (approximate 2 min) X2 ９． 70% Ethanol (2 min)→85% Ethanol (2 min)→100% Ethanol (2 min)→air dry １０． Preheating of section slide (place the slide on the lid of water bath at 73℃ before preparation and denaturation of probe solution) １１． Prepare probe solution (for example: 7μl hybridization buffer + 1μl probe + 2 μl DDW for CEP probe, Vysis) １２． Denature probe solution at 73℃ for 5 min then move to 45℃ １３． Denature the section in a denaturation solution at 73℃ for 5 min. １４． 70% Ethanol (2 min at -4 to -20℃)→85% Ethanol (2 min at -4 to -20℃)→ 100% Ethanol (2 min at -4 to -20℃)→air dry １５． Hybridization at 37℃→ cover and seal the section with coverslip and rubber cement １６． Mark on the section slide １７． Incubation at 37℃ for 3 days Denaturation solution 　　　7ml 20X SSC 　　　14ml H2O 　　　49ml formamide Day 4 １． Remove rubber cement from slide and immerse in 2X SSC/0.3% NP-40 at room for 2-5 minutes. ２． 2X SSC/0.3% NP-40 at 73℃ for 2 minutes ３． 2X SSC/0.3% NP-40 at room for 1 minute ４． 70% Ethanol (1 min)→85% Ethanol (1 min)→100% Ethanol (1 min)→air dry ５． Counterstain and apply coverslip→observation under fluorescence microscope. 2X SSC/0.3% NP-40 　　　4ml 20X SSC 　　　36ml H2O 　　　120μl NP-40 ▲ページトップへ ・ 染色体標本スライドの前処理 カルノア固定 4℃　30分 風乾（しっかり乾かす） ２×SSC 10分（エージング） ペプシン処理 ７分　　(0.5mg/ml pepsin pH2.0)（結果をみて適宜調整） PBS ５分 １% formaldehyde ５分 PBS ５分 70%, 80%, 100% エタノール 各１分 風乾 75℃ウォーターバスのステンレス製蓋の上に放置　　2時間 ・ 試薬 1% formaldehyde 　　　10%中性緩衝ホルマリン 12.5ml 　　　１×PBS 37ml 　　　２M　MgCl2 0.5ml 0.5 mg/ml pepsin (pH 2.0) 　　　0.01N-HCl で希釈　　 10%　ペプシン 0.25ml 　　　H2O 50ml 　　　1N HCl 500μl ・ プローブの単鎖化処理（0.5mlの黄色チューブが便利） １） プローブの作成（上から順番に入れる） Human COT-1 DNA 10 μl ３M　酢酸ナトリウム 4.0 μl 100%　エタノール（上等なの） 110 μl 正常人リンパ球DNA（Spectrum Red 標識） 10 μl 腫瘍DNA（Spectrum Green 標識） 20 μl 以上をよく混和ﾞする。 ２） 遮光箱に容れ、転倒混和し−80℃に一晩置く（１時間以上置く） ３） 12000回転4℃ 20分遠心 ４） 上清を捨てる。 ５） 70% エタノールを200 μl入れ12000回転10分 ６） 上清を捨て、紙縒で残った水分を吸い取る。 （ここで、DNAの白い塊を紙縒にくっつけない様に気をつける。遮光しながら乾かす。1 - 2時間程度） ７） Master Mixを10μl加えよく混和する。管壁についたMaster Mixを10秒程度遠心して落とす。 ８） ３７℃で約１０分保温（遮光） ９） チューブ内のプローブを撹拌する。 １０） ４５℃に１０〜１５分静置。 １１） ７５℃に６分処理。（ﾌﾟﾛｰﾌﾞの変性） １２） ３７℃に３０分以上静置。 ・ 染色体標本の単鎖化処理 １） スライドグラス（スライドの裏に印をつける）を37℃に10分ぐらい置いて 75℃の上に１時間〜２時間置く。 ２） Denaturing　Solution（75℃）にスライドグラスを２分１０秒〜２分３０秒（単鎖化） 注）スライドグラスを１枚入れると約１℃下がるので１度に２枚以上処理しない。 ３） 70．80．100 ％エタノール（氷中）にて２分間づつ脱水する。 ４） 風乾する。 ５） 37℃のホットプレート上で温めておく。 ・ ハイブリダイゼーション １） スライドグラスにプローブを10 μl滴下する。 ２） 18×18mmのカバーグラスにて被い、ペーパーボンドで周囲をシールする。 ３） 30分間ホットプレート（37℃）上に静置する。 ４） 37℃の恒温室にて72時間ハイブリダイゼーションする。 ・ 洗浄 １） ５０％ホルムアミド/2×SSC 45℃　　６分×３回 ２） ２×ＳＳＣ　45℃　　 　　　７分×１回 ３） ＰＮ　　　　　　　　　 　　　 ５分×１回 ４） ＤＷ　　　　　　　　　 　　　 ５分×１回 ５） 水を切って37℃のホットプレート上に５分〜10分（乾燥を確認） ６） ＤＡＰＩⅡ 10μlを滴下し、18×18ｍｍのカバーグラスをかけマニキュアでシールする。 乾燥後プ レパラート箱に入れ常温で保存。 ・ 試薬の調整 20×SSC NaCl 43.8ｇ 175.3g C6H5O7Na3・2H2O 22.1ｇ 88.2g 蒸留水 200ml 800ml メスアップ用（蒸留水） ＋α ＋α 250ml 1000ml PHメーターでPHを7.0に１NのHClであわせその後メスアップ。 ・変性溶液（D.S）100ml 　　ホルムアミド70ml　・20×SSC（ｐH7.0）10ml　・蒸留水20mlを加えて良く混合する。 　　PH7.0 であることを確かめる。 ・エタノール洗浄液 　　蒸留水と100％エタノールを用いて70％　80％　100％の最終濃度となるように希釈する。 ・ホルムアミド洗浄液50 %formamid/2×SSC 　　ホルムアミド75ml　20×SSC(pH7.0)15ml 蒸留水60mlを良く混合する。 　　室温でｐHメーターを用いてｐH7.0に調整する。 　　3個のガラス製コプリンジャー（1，2，3と表示して）に入れる。 ・PN　2×SSC/0.1％NP−40（100ml） 　　90mlの蒸留水に20×SSC（ｐH7.0）を10ml加える。0.1mlのNP—40を加える。NaOHでｐH 7.0に調整する。 ▲ページトップへ PROTOCOL FOR MANUAL TISSUE MICRODISSECTION This method is applicable to various kinds of cancer tissues to reduce stromal tissue components from cancer specimens. Investigators should also expect to invest time initially by practicing on 10 to 20 cases to begin to feel comfortable with the technique. As they become skilled in the microdissection technology, they obtain tissue fragments rich in cancer cells in a short time. I. Preparation of frozen tissue sections 1. Set the machine (cryo-stat) for -20℃ (It takes at least a few hours to get the optimal temperature. Fortunately, the machine is usually maintained at -20C in this laboratory.) 2. Squeeze one drop of OCT compound (Tissue Tek) in bottom of mold, then put the tissue specimen in the center of it, and full the mold by OCT compound. (avoid to trapping air bubbles) *Embed fresh tissues carefully in OCT in plastic mold, taking care not to trap air bubbles surrounding the tissue. Freeze tissue by setting mold on top of liquid nitrogen until 70-80% of the block turns white and then put block on top of dry ice. The frozen blocks may be stored at minus 80°C for long-term　storage. 3. Put mold in machine for 20-30 minutes. 　　This process can be omitted, when the tissue specimens frozen by another method are used. 4. Take out the cylinder from machine and placed one drop of compound on up of fit for mold fixation, Convert the mold and put in top of the cylinder, leave it for 10 minutes in the machine. 5. Remove mold’s frame (plastic). 6. Adjust the cylinder for tissue sectioning. 7. Cut the tissue block with a razor at 5μm, and put on the slide nicety. (A tissue section is prepared for microscopic observation. When the density of cancer cells is very low, another tissue specimen should be used.) 8. Then, section the tissue block at 30μm. 9. Make totally 12-16 slides with repeat of procedures No. (7 to 8 ). 10. Leave slides in Ethanol 100% for 5minutes. 11. Stain tissue sections with HE. 　　The lower concentration of hematoxylin and eosin may improve macromolecule recovery. 12. Arrange slides on the map-wood, and put a cover glass only on 5μm-Sections. 　　We should evaluate the cancer cell content in the tissue section before beginning microdissection. II. Tissue microdissection - Picking up the cancer cells 　　We perform microdissection on a standard inverted microscope (stereomicroscope) using a 27 gauge needle on a syringe as the microdissecting tool. 　　Prepare in advance;　①1.5ml-eppendorfe tube 　　　　　　　　　　　　　　　②70%-ethanol 　　　　　　　③1ml-syringe with 27G needle 1. At first, spill a little of Ethanol on the slide, look for cancer cell nest, and take out that by needle of syringe, put it in the eppendorf tube (tube with 1/2 volume alcohol). While viewing the tissue through the microscope, the cell population of interest should be gently scraped with the needle. (As another way, first stromal tissues are removed from cancer tissue specimens, and cancer cell populations are left on the slide.) The dissected cells will become detached from the slide and form small dark clumps of tissue that can be collected on the needle. Several small tissue fragments can be procured simultaneously. Collection of an initial fragment on the tip of the needle will assist in procuring subsequent tissue. The tip of the needle with the　procured tissue fragments should be carefully placed into a small PCR tube containing ethanol. Gentle shaking of the tube will ensure the tissue detaches from the tip of the needle. 2. Centrifuge the tube for 5minutes at 14,000rpm. 3. Remove the alcohol only, soak the tissue fragments in PBS, and centrifuge the tube for 5 minutes at 14,000rpm. 4. Remove PBS. 5. Go to the DNA extraction step (Dneasy tissue kit, QIAGEN, or SepaGene, Sankojunyaku Co., Ltd.) DNA EXTRACTION FROM MICRODISSECTED TISSUE SPECIMENS DNA extraction is performed with a DNA extraction kit according to the manufacturer’s instructions. We use two kits (products of Sanko-junyaku and Quagen) for DNA extraction. ▲ページトップへ Immunohistochemical examinations that are inevitable to a precise histopathological diagnosis in pathological laboratories are time consuming, laborious and expensive. In order to make immunohistochemical examination efficient, we have developed a novel device designated as ‘Multiplex-Immunostain Chip (MI Chip)’ for immunostaining of tissue sections and smear preparations. On a plastic plate, there are 50 small hallows which contain optimally diluted 5μl antibody solution. A tissue section is placed on the plate and fastened with clips tightly. Then, they are turned upside down, resulting in the automatic application of antibodies to the section. Since the plate allows immunohistological staining of 50 different antibodies at the most for a tissue section in a single experiment, it markedly reduces the time, effort, and expense to the immunohistochemical examination. In addition, expensive bioanalytical instruments are unnecessary for it. The chip is useful for not only histopathological examinations but also genetic studies. A number of applications of this method can be envisioned in the field of tumor diagnosis and cell biology. ▲ページトップへ
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